РЕЗЮМЕ:
агоністи рецепторів μ-опіоїдів є основою контролю над болем. Однак терапевтичне використання цих агентів пов’язане з серйозними побічними ефектами, включаючи потенційну смерть внаслідок центральної дихальної недостатності. Відповідно, вже давно існує інтерес до розробки нових опіоїдних анальгетиків з поліпшеними терапевтичними профілями. Алкалоїди Південно-східного азіатського рослини кратома, представлені мітрагінін, являє собою незвичайний клас опіоїдних рецепторних модуляторів з різними фармакологічними властивостями. Тут ми описуємо перший рецептор-рівень функціональної характеристики мітрагінін і пов’язаних з ним природних алкалоїдів в людських μ-, κ- і δ-опіоїдних рецепторах. Ці результати показують, що мітрагінін і окислений аналог 7-гідроксімітрагінін, є частковими агоністами людського рецептора μ-опіоїдів і конкурентних антагоністів при κ- і δ-опіоїдних рецепторах. Ми також показуємо, що мітрагінін і 7-гідроксімітрагінін є G-білковими агоністами μ-опіоїдних рецепторів, які не набирають β-аррестін після активації рецептора. Отже алкалоїдні скаффолди Мітрагіни представляють собою нову основу для розробки функціонально відхилених опіодних модуляторів, які можуть демонструвати поліпшені терапевтичні профілі. Також представлений енантіоселектівний загальний синтез як (-) мітрагінін, так і його ненатурального енантіомера – (+) мітрагінін, використовуючи пролин-каталізують послідовність реакцій манних-Міхаеля, як ключового перетворення. Фармакологічна оцінка (+) мітрагінін показала більш слабку опіоїдних активність. Аналогічним чином, проміжні і хімічні перетворення, розроблені в загальному синтезі, дозволили з’ясувати раніше не досліджені взаємозв’язки “структура-активність” (SAR) в межах скаффолдов Мітрагіни. Дослідження молекулярних сполук в поєднанні з спостережуваної хімічної взаємозв’язком “структура-активність”, припускають, що алкалоїди Мітрагіни приймають сполучна положення в μ-опіоїдних рецепторах, що, в свою чергу, відрізняється від процесів в класичних опіоїдах.
ВСТУП
Опіоїдні рецептори і, зокрема, μ-опіоїдний рецептор, є одними з найбільш тривало і інтенсивно вивчених молекулярних сигнальних систем в центральній нервовій системі. Аналогічно, прототипний малий молекулярний агонист цих рецепторів – морфін, використовувався людьми в якості важливого анальгетика і розважального ейфоріанта з давніх часів. Дійсно, агоністи μ-опіоїдних рецепторів, включаючи не тільки сам морфін, але також величезна кількість синтетичних і напівсинтетичних опадів, залишаються золотим стандартом болезаспокійливих засобів. На жаль, гостра активація μ-опіоїдних рецепторів також пов’язана з серйозними побічними ефектами, включаючи дихальну недостатність, запор, седативний ефект, нудоту і свербіж. При досить високих дозах, викликана дихальна недостатність, може бути фатальною. Крім того, виражена ейфорія, викликана агоністами μ-опіоїдних рецепторів, робить їх найбільш широко споживаними наркотиками. Ці властивості привели до того, що передозування, що викликається рецептурними опіоїдними анальгетиками, є лідируючою причиною раптової смерті в Штатах. Так в 2014 році від передозування загинуло більше 18 000 чоловік. Іншим недоліком агоністів μ-опіоїдних рецепторів є швидкий розвиток толерантності до їх знеболюючим ефектам. Таким чином, поступове тривалий збільшення дози стає необхідним для підтримки еквівалентного рівня болезаспокійливого ефекту. Точно так же, при зловживанні, толерантність до ейфоричним ефектів опіоїдів розвивається досить швидко. Таким чином в будь-якому випадку, хронічне використання часто призводить до важкої фізичної залежності від агоністів μ-опіоїдних рецепторів через клітинного і циркулюючого рівня адаптації при безперервної стимуляції рецепторів. Відповідно, багато зусиль було присвячено розробці нових агоністів μ-опіоїдних рецепторів, які зберігають сильний знеболюючий ефект, але в той же час сприяють пом’якшенню або усунення згубних побічних ефектів агентів, які використовуються в даний час. Історично агоністи μ-опіоїдних рецепторів також застосовувалися в лікуванні розладів настрою, в тому числі важкого депресивного розладу. Дійсно, до середини 20-го століття, низькі дози самого опіуму, використовувалися для лікування депресії, і так зване «опіумна лікування» було, імовірно, досить ефективно. З появою трициклічнихантидепресантів в 1950-х роках, психіатричне використання опадів швидко скоротилося і практично не застосовувалося на практиці, ймовірно, через негативні медичних і соціальних уявлень, викликаних можливістю зловживання. Однак є окремі клінічні доповіді (як тематичні дослідження, так і невеликі контрольовані клінічні дослідження) з 1970-х років, що показують ефективність агоністів μ-опіоїдних рецепторів в лікуванні депресії. Повідомлялося, що навіть у пацієнтів, стійких до лікування, відбувалося швидке і надійне поліпшення симптомів важкого депресивного розладу (або тривожних розладів), в клінічних умовах за допомогою впливу нейропептіда β-ендорфіну, а також ряду невеликих молекул. Ці результати були коротко охарактеризовані за допомогою моделей гризунів, де цілий ряд агоністів μ-опіоїдних рецепторів демонстрували антидепресивну дію. Зовсім недавно, ми виявили, що атиповий антидепресант тианептин, який використовувався клінічно протягом декількох десятиліть і широко вивчався на гризунах і інших видах ссавців, є агоністом μ-опіоїдних рецепторів. Передбачається, що цей агент надає антидепресивну дію за допомогою активного прямого залучення μ-опіоїдних рецепторів. На жаль, лікування важкого депресивного розладу з традиційними агоністами μ-опіоїдних рецепторів, як очікується, зіткнеться з тими ж проблемами, що і їх використання в контексті лікування болів. Відповідно, наші лабораторії займалися дослідженнями структурно і фармакологічно різних класів агоністів μ-опіоїдних рецепторів, з метою розробки нових опіоїдних методів лікування депресивних розладів і болю, які виключають класичні побічні ефекти опіоїдних агентів. Саме в цьому контексті нас зацікавило психоактивну рослина Mitragyna speciosa, відоме як «Крат» в Таїланді, або «biak biak» в Малайзії. Речовина, яку протягом століть використовувалося людьми в Південно-Східній Азії для лікування різних недуг. Зазвичай рослинний матеріал споживається у вигляді чаю або безпосередньо при жуванні. При низьких дозах Крат насамперед використовується для стимулюючих ефектів. У більш високих дозах, переважають опіоїдні ефекти, а рослина використовується як загальний анальгетик і в якості замінника опіуму або для лікування абстинентного синдрому, викликаного опіумом. Відомі інші лікарські застосування, включаючи використання в якості лікування лихоманки, кашлю, діареї і депресії. Існує також прецедент для використання рослини в оздоровчих цілях, що юридично сприяло легалізації кратома як в Таїланді, так і в Малайзії, але рослина залишається неконтрольованим поза ним ендемічних регіонах. Завдяки добре документованим лікарським властивостям, були вивчені молекулярні складові кратома, відповідальні за його психоактивні ефекти. Причому в рослині було ідентифіковано більше 20 унікальних індольних алкаллоідов. Індольного алкалоїд мітрагінін є основним алкалоїдний компонентом кратома, на який припадає до 66% по масі неочищеного алкалоідного екстракту. Було виявлено, що інші алкалоїди в рослині включає в себе C23H28N2O4 (paynantheine), C23H30N2O4 (specoogynine) і C23H30N2O4 (speciociliatine). Величини цих основних алкалоїдів, поряд з широким розмаїттям малих алкалоїдів, значно різняться серед різних регіональних сортів рослини, а також залежать від віку рослин. Це фактори, які значно ускладнюють інтерпретацію, що повідомляються психоактивних ефектів, від сирого рослинного матеріалу. Серед другорядних алкалоїдів, окислене похідне 7-гідроксімітрагінін (7-ОН) представляє особливий інтерес, оскільки, як повідомляється, знеболюючі ефекти, опосередковані агоністичної активністю в μ-опіоїдних рецепторах, перевершують по ефективності прототипи опиоидного агоніста морфін. Механізм дії алкалоїдів Мітрагіни були вивчені як in vitro, так і in vivo. Зокрема, Такаяма і співробітники накопичили велику кількість доказів залучення системи опіоїдних рецепторів в якості первинного медіатора психоактивних ефектів цих алкалоїдів. Зокрема, обидва: мітрагінін і 7-OH, проявляють наномолярний схожість зв’язування для μ-опіоїдних рецепторів і володіють функціональною активністю в тканинних аналізах. Аналогічно, антиноцицептивні ефекти мітрагінін і 7-ОН в декількох дослідженнях з гризунами також інгібувати налоксоном. Незважаючи на ці докази участі опіоїдної системи і, зокрема, μ-опіоїдних рецепторів, при опосередкування знеболюючих ефектів алкалоїдів Мітрагіни, на цей рахунок є суперечливі доповіді в літературі. Перш за все, ранні дослідження з мітрагінін показали, що поведінкові ефекти у кішок і болезаспокійливі ефекти у щурів, не минулися шляхом лікування налорфін (опіоїдний антагоніст), в той же час, мітрагінін значно рідше викликає дихальну недостатність, ніж кодеїн. Було показано, що мітрагінін зв’язується в деякій мірі з декількома неопіоіднимі рецепторами ЦНС, включаючи альфа-2 адренергический рецептор (α2R), аденозин A2a, допамін D2 і серотонінові рецептори 5-HT2C і 5-HT7, але міцність цих взаємодій не відома. Було встановлено, що обезвалівающій ефект мітрагінін відзначено зниження α2R антагоністом ідазоксаном і неспецифічним антагоністом серотоніну Ципрогептадин. З огляду на безліч можливих плутають факторів на рівні тканини або системи, аналізи тканин in vivo і ex vivo не ідеальні для підтвердження функціонального ефекту при специфічному рецепторі. Хоча дослідження рецепторного рівня функціональної активності (зв’язування [_ (_ ^ 35) s] GTPγS) з використанням клонованих опіоїдних рецепторів були зареєстровані для кількох синтетичних окислених аналогів, аналогічних функціональних досліджень не проводилося для самого мітрагінін або інших зустрічаються в природі алкалоїдів кратома. З огляду на унікальну і досі неясну молекулярну фармакологію, навколишнє алкалоїди Мітрагіни, ми провели ретельний огляд мітрагінін і числа природних, і нових аналогів в опіоїдних рецепторах, вимір активації рецептора і внутрішньоклітинного сигналу.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ
Мітрагінін є частковим агоністом людського μ-опіоїдних рецепторів. Ми виділили чотири основних алкалоїду з тайського штаму кратома і отримували 7-OH фотохимическим окисленням мітрагінін. Цікаво, що тільки кількість домішок 7-ОН спостерігалися (по мас-спектрометрії) в нашій екстракції сирого рослинного матеріалу, і було неможливим виділення будь-якого вимірного кількості цієї похідної. Отже, дуже сумнівно, що цей алкалоїд є універсальною складовою всіх препаратів на основі кратома і навряд чи взагалі враховує психоактивні властивості цієї рослини. Потім ми вирішили оцінити активність цих сполук в клітинах HEK, що експресують μ-опіоїдний, κ-опіоїдний і δ-опіоїдний рецептори з використанням резонансного переносу енергії біолюмінесценції. У цих G-протеїн-залежних аналізах, субодиниця Gα злита з донором люціферази (RLuc8), і субодиниця Gγ злита з флуоресцентним протеїновим акцептором. Таким чином, при активації рецептора, субодиниці білка G розсуваються, і спостережуваний резонансний перенос енергії біолюмінесценції зменшується. У опіоїдних рецепторах людини (ч-μ-опіоїдний, κ-опіоїдний і δ-опіоїдний рецептори) мітрагінін діє як частковий агоніст в μ-опіоїдних рецепторів (EC50 = 339 ± 178 нМ, максимальна ефективність (Emax) = 34%). Цей результат є першою демонстрацію функціональної активності опиоидного агоніста в рецепторах людини з природним алкалоїдом Мітрагіни, всі попередні функціональні дослідження, були проведені in vivo або ex vivo в тканини гризунів. З іншого боку, в людському κ-опіоїдних рецепторів, мітрагінін був конкурентним антагоністом (IC50 = 8,5 ± 7,6 мкМ, pA2 = 1,4 ± 0,40 мкМ), повністю ингибирующим активність референсного агоніста U-50,488. Аналогічним чином мітрагінін діє як антагоніст при ч-δ-опіоїдних рецепторів, але з дуже низькою ефективністю. Інші основні природні алкалоїди paynantheine, speciogynine і speciociliatine не показали практично ніякої вимірної агоністичної активності для будь-якого з опіоїдних рецепторів людини при концентраціях до 100 мкМ (спостерігалися тільки слабкі антагоністичні ефекти). Окислений аналог 7-OH був охарактеризований як сильний частковий агоніст ч-μ-опіоїдних рецепторів (ЕС50 = 34,5 ± 4,5 нМ, Emax = 47%). Крім того, він виступав в якості конкурентного антагоніста на обох ч-κ-опіоїдних рецепторах (IC50 = 7,9 ± 3,7 мкМ, pA2 = 490 ± 131 нМ) і ч-δ-опіоїдних рецепторів (IC50> 10 мкм). Часткова агоністичного активність мітрагінін і 7-ОН для рецепторів людини була додатково підтверджена в антагоністичних експериментах, оскільки обидва з’єднання могли частково пригнічувати реакцію, викликану повним агоністом DAMGO. Щоб додатково підтвердити опіоїдних активність алкалоїдів Мітрагіни, ми провели дослідження зв’язування радіоліганда для оцінки афінності природних алкалоїдів і 7-ОН для опіоїдних рецепторів. Як і очікувалося з їх активності, в наших функціональних аналізах як мітрагінін, так і 7-OH проявляли значну спорідненість зв’язування для ч-μ-опіоїдних рецепторів. Аналогічно, інші природні алкалоїди також пов’язані з ч-μ-опіоїдних рецептором, відповідно до їх антагоністичною активністю функціональних аналізах. Зв’язування спостерігалося також для мітрагінін і 7-OH при ч-к-опіоїдних і ч-δ-опіоїдних рецепторів, що також узгоджується з результатами функціональних аналізів. Крім того, значення Ki, певні в експериментах зв’язування, відповідали значенням EC50 і IC50 (після корекції за рівнянням Ченга-Прусоффа), визначеним у функціональних експериментах, або значенням pA2 (оцінка Kd), що визначаються аналізом Шильда. Аналогічні результати зв’язування також були отримані для мишачих опіоїдних рецепторів. Крім того, наші дані про зв’язуванні з 7-ОН відповідали попередніх публікацій в літературі (з використанням гомогенатов головного мозку морської свинки), але подібності, визначені для мітрагінін в μ- і δ-опіоїдних рецепторах, були значно слабкіше, ніж було описано раніше. З огляду на, більшою мірою узгоджуються дані in vitro і відносну активність мітрагінін і 7-OH in vivo, можемо припустити, що ці нові дані є більш надійними. У сукупності функціональні результати і результати зв’язування забезпечують сувору і внутрішньо несуперечливу оцінку активності in vitro алкалоїдів Мітрагіни у всіх трьох опіоїдних рецепторів людини. Дивно, але аналогічні аналізи з використанням рецепторів гризунів (миші або щури) показали, що мітрагінін не проявляє агоністичної активності, і замість цього він виявився чинним як конкурентний антагоніст мишачого μ-опіоїдних рецепторів (IC50 = 1,1 мкМ, pA2 = 807 ± 573 нМ), повністю пригнічуючи активацію, викликану еталонним агонистом DAMGO. Інші ізольовані натуральні продукти, paynantheine, speciogynine і speciociliatine не показали жодної помітної агоністичної або антагоністичної активності у будь-якого з опіоїдних рецепторів гризунів. Навпаки, активність 7-ОН була подібною у рецепторів гризунів. Ці спостереження ускладнюють інтерпретацію попередніх звітів про аналгезирующих ефекти, викликаних мітрагінін в моделях з гризунами. Крім того, це міжвидові зміна може представляти значні проблеми при розробці з’єднань цього класу в якості нових терапевтичних засобів, оскільки активність в моделях з гризунами не може бути легко переводиться на людей. На щастя, могутніша похідна 7-ОН зберігає свою агоністичного активність при мишачому μ-опіоїдних рецепторів, так як окислений скаффолд є більш перспективною відправною точкою для розвитку анальгетиків в цьому класі. Що стосується мітрагінін, то також можна припустити, що аналізи in vitro, що використовуються в нашому дослідженні, точно реплікують активацію рецептора і сигналу в нативної мишачої тканини головного мозку. Наприклад, низькоефективних частковий агоніст (що знаходиться в мозку) може проявлятися як антагоніста в клітинних тестах. Таким чином, розгляд міжвидових відмінностей рекомендується для майбутнього розвитку цих сполук.
Селективність внутрішньоклітинних сигналів алкалоїдів Мітрагіни до G білків.
Функціонально селективні агоністи опіоїдних рецепторів, які переважно активують тільки деякі шляхи передачі сигналів, є багатообіцяючими анальгетиками або антидепресантами з зменшеними побічними ефектами. З огляду на потенціал для поділу добре встановлених терапевтичних переваг активації μ-опіоїдних рецепторів від негативних побічних ефектів, дослідження функціонально-селективних μ-опіоїдних-лігандів є розвивається і перспективною галуззю дослідження в даний час. Тому ми були зацікавлені у вивченні потенціалу використання унікального молекулярного скаффолда мітрагінін в якості відправної точки для розробки селективних агоністів μ-опіоїдних рецепторів. Щоб оцінити рівень, викликаного, за допомогою алкалоїдів Мітрагіни, β-аррестін рекрутингу, ми використовували недавно описаний резонансний перенос енергії біолюмінесценції в трансфікованих клітинах HEK, який був адаптований для використання з опіоїдними рецепторами. У цьому аналізі немічених рецептор (в даному випадку ч-μ-опіоїдний рецептор) трансфіціруют разом з β-аррестін-2 (аррестін-3), що злиться з люціферази (RLuc8) і SH3-зв’язує областю (Sp1), а так само мембранний білок GAP43, злитий з флуоресцентним білком (цитрином) і SH3. Відповідно, коли агоніст індукує розподіл β-аррестіна в μ-опіоїдних рецепторів, область Sp1 на β-аррестіне виявляється в безпосередній близькості до локалізованої мембраною SH3-області і тоді відбувається взаємодія. Це призводить до супутньої асоціації донора люціферази і акцептора флуоресцентного білка, після чого спостерігається сигнал резонансного переносу енергії біолюмінесценції. Перевага цього формату полягає в тому, що можна використовувати нативний рецептор, уникаючи можливих плутанини, пов’язаних з C-термінальної відміткою при експресії або на функції. Як зазначено в аналізі сигналів клітин – DAMGO індукував стійкий набір β-аррестіна. Цікаво, що і мітрагінін, і 7-ОН, як було виявлено, не викликають ніякого вимірного зв’язування β-аррестіна, навіть в присутності G-білкового рецептора кінази 2 (GRK2), який зазвичай підсилює зв’язок з β-аррестіном. Через це вкрай слабкого сигналу ми не змогли кількісно оцінити величину функціональної селективності для мітрагінін і 7-ОН. Однак, оскільки обидва сполуки виявляють значну ефективність для активації при G-білковому аналізі дисоціації, існує сильне якісне усунення на користь передачі сигналів G-білка в цих клітинах. Таку селективність для G-білково-залежного сигналу може пояснити зменшення дихальної недостатності, про що раніше повідомлялося для мітрагінін в порівнянні з кодеїном, хоча будь-яка така зв’язок між сигналами висхідного рецептора і фізіологічними властивостями повинна розглядатися, як спекулятивна. У будь-якому випадку, як мітрагінін, так і 7-OH сигнали, істотно відрізняються від сигналу, викликаного DAMGO. Ці результати забезпечують хороше обгрунтування майбутніх експериментів, спрямованих на вивчення клітинних сигналів (у відповідних клітинах нейронів) і відображення ефектів структурних змін на рівні функціональної селективності.
Дослідження взаємозв’язку “структура-активність”: Стратегія.
Підтвердивши агоністичного активність μ-опіоїдних рецепторів мітрагінін і 7-OH, ми вирішили вивчити кілька ключових взаємозв’язків “структура-активність” (SAR) в даному скаффолде. Зокрема, нас цікавили ефекти модифікацій в трьох положеннях: метоксігруппи в положенні 9, етільний група на D-кільці і β-метоксіакрілат група. Арілметоксігруппа в положенні 9 представляла практичний інтерес, в класичних морфинана і бензоморфан опіоїдних скаффолдах, зміна від арілметоксі до фенолу в ключовому положенні 3 (наприклад, від кодеїну до морфіну), як правило, призводить до різкого збільшення активності. Аналогічно, незаміщені фенільні аналоги в цих скаффолдах також проявляють слабку активність. Важливість фенольной групи в багатьох відомих μ-опіоїдних-лігандах обумовлена утворенням Вологозв’язуючий водневої зв’язку з H297 (6.52), як показано в двох недавніх рентгенівських знімках кристалічних структур μ-опіоїдних рецепторів. Відповідно, було висунуто припущення що, якщо мітрагінін зв’язується в подібному положенні, то відповідний десметил-аналог продемонструє значно збільшену активність. Ми також передбачили спрощення заступників D-кільця селективним видаленням ефіру Енола або бічній етільной групи, аналоги, які будуть вивчати раніше недосліджені взаємозв’язку “структура-активність” в цій галузі.
Енантіоселектівний загальний синтез мітрагінін і аналогів.
Хоча 7-OH і десметил-похідне були отримані з ізольованого природного продукту, ми також хотіли провести повний синтез мітрагінін, який дозволяє створити більш видозмінені аналоги. Відповідно, ми передбачили початок синтезу з 4-метоксііндол, де С-кільце може бути отримано через реакцію Бішлера – Напіральского, щоб отримати 3,4-дигідро-β-карболіни. Потім цей проміжний продукт піддають енантіоселектівной, пролін-катализируемой циклізації по манних-Майклу з відповідним Еноні щоб встановити D-кільце і розмістити стерео центру в положенні 3. Ця трансформація розроблена Іто (Itoh) і його колегами, і була успішно застосована в загальному синтезі декількох структурно подібних індольного алкалоїдів. Отриманий тетрациклічними кетон послужив би універсальним проміжним з’єднанням для синтезу різноманітних аналогів, включаючи сам мітрагінін. Необхідний 3,4-дигідро-β-карболіни був успішно підготовлений в шестіетапной послідовності, починаючи з комерційно доступного 4-метоксііндол (загальний вихід 21%). Необхідний Енан синтезували з метил-2-етил-3-оксобутаноата відповідно до раніше описаними процедурами. За допомогою необхідних структурних елементів ми спробували зробити ключовий пролин-опосередкований крок для освіти D-кільця. Початкові експерименти з неочищеним β-карболіни, обробленим надлишком Еноні в присутності пролина, дають бажані кетони з помірним виходом у вигляді суміші епімерів. Важливо відзначити – ми виявили, що основний діастереомер був отриманий в високому енантіомерний надлишку, тоді як не основний діастереомер був отриманий в значно меншій кількості. Після оптимізації умов реакції (украй важливо очистити β-карболіни за допомогою хроматографії), бажаний ізомер кетона може бути отриманий з хорошим виходом і чудовим надлишком енантіомера. Щоб раціоналізувати стереоселективність цієї трансформації, можна уявити двоетапний механізм взаємодії, в якому проходить реакція (подібна реакції манних) між пролин-енаміни Еноні і β-карболіни спочатку встановлює стерео центру в позиції 3. Потім слід внутримолекулярное приєднання Майкла, щоб замкнути кільце. На останньому етапі пролин контролює умови протонирования під час гідролізу, тим самим також впливаючи на стерео центру в положенні 19. Пролін, як вважають, бере участь в управлінні стереохімію при 19 положенні. Так як, отримане в реакції діастереомерних співвідношення варіюється і відрізняється від спостережень, коли один з кетонів епімерізуется в лужному середовищі. Таким чином, орієнтація цього стерео центру обумовлена не просто термодинамічних рівновагою кетонові продукту. З ключовим проміжним кетоном наступний етап синтезу був здійснений епімерізаціей бічній етільной групи в відповідну β-стереохимическую конфігурацію (як в мітрагінін). Цього не можна досягти термодинамічних рівновагою кетона з підставою або кислотою, оскільки бажані стереохимические позиції етільной групи знаходяться в менш сприятливої осьової конфігурації. В якості альтернативної стратегії ми припустили, що псевдоалліл деформується в ен-ефірний продукт реакції Хорнера-Водсворт-Еммонса (HWE) або до відповідного перехідний стан, може бути використаний, щоб порушити рівновагу від екваторіального вирівнювання. Отже, кетон обробляли карбаніони, утвореним з метілдіетілфосфоноацетата і часткова епімерізація дійсно була помічена. Ене-ефір з бажаної аксиальной етільной групою отримували у вигляді суміші ізомерів E і Z, 8E і 8Z (55 мовляв.% Від загальної кількості продукту по ЯМР), тоді як енерго-ефір зі збереженням конфігурації в етільной групі, був отриманий виключно у вигляді E-ізомери (45 мовляв.% від загального продукту за допомогою ЯМР). На жаль, низька реакційна здатність кетона зажадала використання великих надлишків фосфоноацетата, що призвело до часткової трансетеріфікаціі метил естери. З тим, щоб етільний група була успішно епімерізована в відповідне положення, змішані енерго-ефіри 8E / Z були перетворені в (-) мітрагінін за допомогою послідовності з декількох ключових ступенів: одночасне відновлення енерго-ефіру і детозілірованіе магнієм, трансетеріфікація, конденсація по Клайзену ( формілювання) і O-метилювання проміжного з’єднання. Остаточний крок – O-метилювання, забезпечував як (-) мітрагінін, так і ізомерний аналог (Z) -мітрагінін з помірними виходами. Починаючи з кетона і використовуючи ту ж синтетичну послідовність, також був отриманий неприродний енантіомер (+) мітрагінін ,. Порівняння цього матеріалу з природним продуктом за допомогою хіральної ВЕРХ підтвердило їх протилежну стереохімію і, таким чином, абсолютну стереохімію кетонових продуктів, отриманих в циклізації, що каталізує пролином.
Синтез десетілмітрагініна.
З огляду на, що speciogynine, який є епімерним з мітрагінін у бічній етільной групи на D-кільці, була неактивний як опиоидного агоніста in vitro. Ми вважали, що природа і орієнтація заступника в цьому положенні є важливою при розгляді активності, і таким чином, вирішили додатково визначити терпимість скаффолда в цій області за допомогою синтезу аналога десетілмітрагініна. Цей модифікований аналог був приготований за допомогою синтетичної послідовності, аналогічній тій, яка застосовується для синтезу мітрагінін, починаючи з обробки β-карбонила з метілвінілкетоном в присутності D-проліну.
Опіоїдна активність синтетичних аналогів.
З різноманітністю напів- і повністю синтетичних похідних мітрагінін, може бути вивчена ключова взаємозв’язок “структура-активність” цього молекулярного скаффолда на опіоїдних рецепторах. Зокрема, синтезовані аналоги дозволили досліджувати ключові фрагменти, виділені вище, а саме арілметоксігруппу в положенні 9, β-метоксіакрілат і етильну групу на D-кільці (див.вище, Дослідження взаємозв’язку “структура-активність”: Стратегія.). Як і очікувалося, неприродний енантіомер (+) мітрагінін виявився значно слабкіше агоніста при ч-μ-опіоїдних рецепторів, з точки зору як активності, так і максимальної ефективності. Дивно, однак, на відміну від (-) мітрагінін, було встановлено, що він є частковим агоністом з низькою активністю при ч-к-опіоїдних рецепторів (EC50 = 9,1 ± 4,3 мкМ, Emax = 31%). Мабуть, інверсія стереохимии в цьому скаффолде достатня для переходу від антагоністичної до агоністичної активності в ч-к-опіоїдних рецепторів. Вивчаючи конкретні функціональні групи, зазначені вище, ми спостерігали кілька важливих тенденцій. По-перше, перехід з метоксігруппи в гідроксигрупу в положенні 9 дуже мало впливав на активність при ч-μ-опіоїдних рецепторів, причому фенольний аналог мав подібну активність і ефективність для самого мітрагінін. Цей результат свідчить про те, що мітрагініновий скаффолд, швидше за все, прийме унікальне зв’язує положення в порівнянні з класичними морфинана і бензоморфнимі опадами, які демонструють істотну взаємозв’язок між їх активністю μ-опіоїдних рецепторів і вразливою фенольной групою. Переміщаючись до β-метоксіакрілатному фрагменту, видалення ефіру Енола, як і в загальному синтезі проміжного з’єднання, повністю виключає активність при ч-μ-опіоїдних рецепторів (як агоністичного, так і антагоністичну). У порівнянні, дуже близький аналог (Z) -мітрагініна, виявилося, володіє дуже схожою активністю до натурального продукту, що вказує на те, що стереохимическая інверсія фрагмента β-метоксіакрілата все ж допускається. І, нарешті, ми звернули нашу увагу на етильну групу на D-кільці. Результати зі speciogynine вже продемонстрували, що епімерізаціі цієї групи було достатньо, щоб перейти від агоністичної до антагоністичної активності при ч-μ-опіоїдних рецепторів, в той же час зменшуючи спорідненість зв’язування. Вивчаючи аналог десетілмітагініна, ми виявили, що ця похідна зберігає агоністичного активність при ч-μ-опіоїдних рецепторів, але з набагато меншою ефективністю. Таким чином, заступник в положенні 19 важливий для контролю ефективності (агоніста проти антагоніста) і активності. Встановлено, що синтетичні похідні, описані тут ((+) мітрагінін) так само можуть не проявляти активність в ч-к-опіоїдних рецепторів і ч- δ-опіоїдних рецепторів (EC50 і IC50 як> 30 мкм). Молекулярне з’єднання демонструє унікальне зв’язує положення.
Щоб раціоналізувати наші емпіричні спостереження взаємозв’язку “структура-активність” в мітрагініновом скаффолде і сформувати майбутню раціональну конструкцію, ми провели попередні дослідження молекулярного з’єднання. Зокрема, AutoDock використовувався для з’єднання мітрагінін і деяких аналогів, описаних вище в сполучному «кишені» агоністичного рентгенівська кристалічна структура м-μ-опіоїдних рецепторів (PDBID = 5C1M). Зв’язує положення (-) мітрагінін в ортостеріческой позиції рецептора, частково перекривається зі сполучною становищем агоніста, отриманого з сокрісталлізованного морфинана похідного, BU72. Хоча (-) мітрагінін і BU72 поділяють полярне взаємодія між їх протоновану амінами і D147, які, як відомо, мають вирішальне значення для зв’язування класичних опіоїдних агоністів і антагоністів, інші важливі ліганд-рецепторні контакти істотно розрізняються. У BU72, фенол займає гідрофобний «кишеню» утворений TM5 і TM6, і формує водно-опосередковану водневу зв’язок з H297 – це взаємодія є загальним для опіоїдних лігандів в класі морфінанов (див. Вище Дослідження взаємозв’язку “структура-активність”: Стратегія.). Навпаки, наші дослідження в області з’єднання припускають, що область метоксііндол (-) мітрагінін переважно спрямована в альтернативний гідрофобний «кишеню», утворений залишками TM2 і TM3, які, як передбачається, не можуть утворити аналогічну водневу зв’язок. Цей результат узгоджується з мінімальною різницею in vitro між (-) мітрагінін і фенольним похідним. Замість цього, область енольного ефіру (частина β-метоксіакрілата) мітрагінін, мабуть, прямує в ту саму ділянку, що і фенол BU72 (до TM5 і TM6). Таким чином, можна припустити, що ця функціональна група бере участь в аналогічній водневої зв’язку з H297, відповідно з повною втратою активності при видаленні цієї групи. Важливість етільной групи на D-кільці також пояснюється передбаченої зв’язує позицією з найменшою енергією (-) мітрагінін. Порівнюючи орієнтацію цього ліганда з лігандом BU72, можна помітити, що етільний група займає практично ідентичну N-метильної групи BU72 область перебуваючи поблизу кількох гідрофобних залишків. Відповідно, втрата цієї групи, буде зменшувати активність і взаємодія гідрофобних ліганд-рецепторів. З’єднання інших мітрагінових аналогів, описаних вище, також дає результати, які узгоджуються з in vitro даними. Наприклад, відповідно до аналогічної in vitro активність по відношенню до (-) мітрагінін, (Z) -мітрагінін прийняв майже ідентичне положення. Аналогічно, передбачена низькоенергетичному зв’язує позиція 7-ОН була такою ж, з усіма основними функціональними групами (акрилатом, етільной групою, третинним аміном і індолом), які займають дуже схожі положення. Цікаво, що 7-гідроксильна група не вступає в тісний контакт з поверхнею рецептора, таким чином, потенційні взаємодії з водневим зв’язком, мабуть, не беруть участі в значному збільшенні активності, викликаному окисленням в положенні 7. Замість цього незначний вигин, введений в структуру ядра за допомогою цієї модифікації, видається більш важливим. Примітно, що хоча (-) мітрагінін взаємодіє з W293 через його акрилатную групу, 7-OH взаємодіє з цим залишком через обидві етил- і акрилатную групи. Навпаки, з’єднання неприродного енантіомера – (+) мітрагінін, виявило значно відрізняється зв’язує положення, повністю протилежне за своєю загальною орієнтації в «кишені», що узгоджується зі слабкою активністю в функціональних аналізах. Ми також поєднали paynantheine, speciogynine і speciociliatine, з’єднання, які зв’язуються з ч-μ-опіоїдними рецепторами, але не виявляють агоністичної активності, натомість виступають в якості конкурентних антагоністів. Розглядаючи paynantheine і speciogynine, перевернуті стереохимической в положення 19 (вінільні або етільний група), що викликає значне зміщення індольного фрагмента по відношенню до TM1 і від TM3, що, в свою чергу, призводить до утворення додаткових контактів з TM1 (Y75 (1.39)) і TM6 (H319 (7.36)), що не спостерігаються при з’єднанні активних сполук. Крім того, гідрофобні взаємодії між індол метоксігруппи і V1433.28 і I1443.29, які спостерігаються з (-) мітрагінін губляться в цих аналогах, що потенційно призводить до зменшення спорідненості до активної конформації рецептора і відповідної антагоністичної активності. Відповідно до перевернутої стереохімію основної структури, з’єднання speciociliatine проявило зовсім інше зв’язує положення з індольної групою, що тягнеться до ТМ3 і утворює полярне взаємодія з Y148 (3.33). Примітно, що, на відміну від інших з’єднань, акрилатна частина в speciociliatine знаходиться в осьовому, а не екваторіальна положенні, яке вказує на TM5 і TM6. В цілому, кількість різних стереохімічних конфігурацій в алкалоідного сімейства Мітрагіни, мабуть, досить, щоб зберегти зв’язування при ч-μ-опіоїдних рецепторів, тоді як абсолютна стереохімія, знайдена в мітрагінін необхідна для активації рецептора.
ВИСНОВОК
У цій роботі ми представили першу ретельну in vitro характеристику фармакології опіоїдних рецепторів і сигналів природних алкалоїдів Мітрагіни в функціональних аналізах на рівні рецепторів. Часткова агоністичного активність (-) мітрагінін на μ-опіоїдних рецепторів, ймовірно, пояснить багато з ефектів екстракту кратома на людину. Однак інші великі алкалоїди, виділені з рослини: paynanthiene, speciogynine і speciociliatine, проявили конкурентну антагоністичну активність у цього рецептора. З огляду на, що в сукупності ці вторинні алкалоїди становили приблизно рівний відсоток від загального вмісту алкалоїдів в порівнянні з мітрагінін в наших екстрактах, то вельми відчутні психоактивні ефекти сирого рослинного матеріалу, ймовірно, будуть являти собою складну взаємодію конкуруючих агоністів і антагоністичних ефектів на опіоїдних рецепторах. Було також виявлено, що сильно окислений аналог 7-ОН не обов’язково присутній у всіх екстрактах рослинного матеріалу (як було припущено раніше), тому потенційний внесок цього алкалоїду до ефектів кратома не є узагальненим, тільки якщо 7-OH не утворюється у вигляді метаболіту. Дослідження з декількома синтетичними мітрагініновимі аналогами дозволило нам визначити базову взаємозв’язок “структура-активність” на кожному з існуючих заступників, у тому числі в областях (D-кільце), які були доступні тільки для дериватизації шляхом повного синтезу. Ця робота показала, що опіоїдна активність в мітрагінінових скаффолдах досить чутлива до структурних змін, і алкалоїди Мітрагіни приймають унікальне зв’язує положення на μ-опіоїдних рецепторів, відмінне від становища на класичних опіоїдах. Ця можливість була додатково підтверджена дослідженнями молекулярної стикування в μ-опіоїдних рецепторів. Перший загальний синтез неприродного енантіомера – (+) мітрагінін, також дозволив нам підтвердити, що зустрічається в природі ізомер є більш активним опіоїдних агоністом. Таким чином, можна сподіватися, що цей скаффолд може являти собою відправну точку для розробки нових опіоїдних анальгетиків з меншою кількістю побічних ефектів. Відповідно, висновок про те, що крім їх активності в μ-опіоїдних рецепторів, як мітрагінін, так і 7-OH є антагоністами до-опиоидного рецептора. В цьому відношенні сам мітрагінін представляє особливий інтерес, оскільки він діє як низько ефективні частковий агоніст μ-опіоїдних рецепторів і антагоніст к-опиоидного рецептора. Було з’ясовано, що обидва ці механізму викликають ефект антидепресантів у тварин, а в разі μ-опіоїдних рецепторів, подібний ефект і у людей. Однак модулятори к-опиоидного рецептора отримали значно більше уваги в психіатрії в останні роки, ймовірно, через їх очевидної відсутності ризику зловживань. Антагоністи цього рецептора є антидепресантами на тваринних моделях і протидіють різноманітним стресових реакцій, які, як вважають, попиту і через ендогенні агоністи к-опиоидного рецептора – динорфінів. Крім того, кілька агентів цього класу увійшли в клінічні випробування для важкого депресивного розладу, але поки ще не досягли ринку. З огляду на здатність мітрагінін порушити обидві ці опіоїдні сигнальні системи в напрямку, згоди з поліпшенням настрою, з’ясувалося, що він проявляє антидепресивну активність в примусовому тесті на плавання (моделювання депресії у гризунів). Таким чином, алкалоїди Мітрагіни також представляються перспективними при лікуванні депресії.
