Рослинні матеріали і обробка саліцилової кислотою

Листя кратома, зібрані в Перліс (Малайзія) були оброблені 100 мМ саліцилової кислоти і зібрані через 2 години. В якості контролю використовували необроблене рослина. Додатковий експеримент для дослідження експресії генів проводили окремо, для цього листя оброблялися 5 мкМ саліцилової кислоти і були зібрані після 24, 48, 72 і 96 годин.

Повна ізоляція РНК і мРНК

Листя подрібнювали в ступці з товкачиком в рідкому азоті і гомогенизировали з 20 мл попередньо охолодженого екстракційного буфера (Тріс-HCl pH 8,5, 300 мМ LiCl, 10 мМ ЕДТА, додецилсульфат натрію 1% вага / об’єм, 5мМ тіосечовини і 1% β -меркаптоетанол) і 6 мл 20% PVP40. Згодом гомогенат центрифугували при 10000 об / хв протягом 15 хв при 4 ° С. Супернатант змішували з 3 М ацетатом натрію і етанолом і інкубували при -20 ° С протягом, щонайменше 2 годин. Потім зразки центрифугували при 10000 об / хв протягом 20 хв при 4 ° С. Осад ресуспендували в 6 мл екстракційного буфера і фенолу: хлороформ (1: 1), а потім перемішали і центрифугували при 10000 об / хв протягом 10 хв при 4 ° С. Верхню фазу інкубували протягом 15 хв при 65 ° С в кінцевій концентрації 0,7 М NaCl і 2 М бромідцетілтріметіламмонія. Потім рівний обсяг хлороформу: ізоаміловий спирт (24: 1) додали в суміш, попутно перемішуючи. Суміш центрифугували при 10000 об / хв протягом 10 хв при 4 ° С. Верхню фазу збирали і інкубували протягом ночі з 3 М LiCl. Суміш центрифугували, і осад ресуспендували в 50 мкл води, обробленої діетілпірокарбонатом. Загальну отриману РНК потім об’єднували для виділення мРНК. Poly A + РНК виділяли з використанням poly (A) tract (Promega).

Субтрактивна конструкція бібліотеки кДНК

Бібліотека була створена за вказівкою виробника (Clontech PCR-Select ™ kit). Продукт PCR клонували в Простий Вектор pGEM-T (Promega). Оточений лигандами продукт потім трансформували в компетентні клітини DH5α і плаковані пластини Amp / IPTG / X-gal для синьо-білого скринінгу. Білі колонії культивували, і плазміди були екстрагованих з використанням milipore plasmid miniprep (Montáge).

EST секвенування і аналіз

В цілому 292 кДНК-клона були відправлені в 1stBASE Laboratories Pte Ltd, Малайзія для секвенування з M13 / pUC прямим праймером. Експресуються ярлики (EST) були очищені і зібрані з використанням програмного забезпечення secqclean і CAP3 відповідно. Пошук схожості був виконаний з урахуванням наявних нерезервованих ген / транскриптов в загальнодоступній базі даних (http.//www.ncbi.nlm.nih.gov/BlastT) з використанням BLASTX і BLASTN. Оцінки подібності між кДНК-клонами і відомі послідовності були представлені BLASTN (e-значення ≤ 10-5).

Напівкількісний аналіз RT-PCR

Було вибрано вісім генів, і їх праймери для ПЛР були розроблені відповідно до отриманих послідовностями (таблиця 1). Були приготовлені реакції для п’яти, різних за часом, курсів. Оптимізовані ПЛР-реакції містили 3 мкл кДНК (200 нг), 1x Green GoTaq® Flexi Buffer, 50 мМ MgCl2, 400 мкМ dNTP, 50 мМ MgCl2 і 2,5 U ДНК-полімерази GoTaq® (Promega). Програма посилення була на Tm 66,5 ° С. Посилені продукти аналізували через електрофорез в 1% агарозних гелях і візуалізували за допомогою бромистого етидія.

Результат і обговорення

Обробка листя

Щоб перевірити вплив високої концентрації саліцилової кислоти на елісітором по експресії генів кратома, листя були оброблені 100 мМ саліцилової кислоти, і результати були проаналізовані. З нашого спостереження листя мають відмінні фенотипічні відмінності після лікування саліцилової кислотою (дані не показано). Морфологічні зміни спостерігалися протягом 2 год після розпилення за допомогою саліцилової кислоти і включали в себе зморшкуватість, прокатку, в’янення і підсмажування листя, особливо молодих пагонів. Після тривалого перебування на рослині листя і пагони зів’яли. Ці морфологічні зміни вказували, що рослина адаптувалося до стресу. Адаптація до стресу сталася, щоб зменшити светообразованіе і втрати води – це крім захисту системи, коли вона активована для підтримки гомеостазу (Oh et al., 2008). Тим часом, ми провели обробку 5мМ саліцилової кислоти, щоб визначити період виживання листя. Ми помітили, що знадобилося 4 дні, щоб листя на рослині повністю зів’яли. На цьому етапі листя легко відокремилися від стебла.

Анотації диференційно виражених кДНК

Після аналізу послідовностей була проведена анотація послідовностей. З результатів секвенування 292 отримані послідовності аналізували з використанням програмного забезпечення Sequence Frontier. Однак тільки 111 послідовностей були чистими і придатними для аналізу. Послідовність векторів потім була обрізана з подальшим вирівнюванням. Грунтуючись на аналізі з використанням програмного забезпечення Seqclean, 43 транскрипта були одноточечного, а 68 транскриптов сходилися до 17 різних контінгам. Пошук BLASTX проводився з 60 з цих Синглетон проти бази даних білка в NCBI. Послідовні гомології перераховані в таблиці 2.

M.speciosa кДНК аналіз субтрактівних бібліотек

На підставі отриманих послідовностей транскрипти були розділені на кілька окремих груп, щоб визначити рівень експресії генів. Семіколічественний аналіз RT-PCR проводився на восьми транскриптах з відомою функцією для вивчення кореляції цих генів з обробкою саліцилової кислотою при низькій концентрації (5 мМ). Результати показали, що отримані кДНК-клони представляють збільшення генів, пов’язаних зі стресом, у відповідь на обробку саліцилової кислотою. Було очевидно, що обробка 5мМ саліцилової кислоти викликало абиотический стрес у M.speciosa. Наш результат узгоджується з попереднім дослідженням, проведеним Rizhsky et al. (2004), в якому проводилося профілювання транскрипції для ідентифікації диференційованих експресованих генів в Arabidopsis при впливі тепла. Транскрипти, отримані з цього дослідження, також пов’язані з реакцією стресу і захистом клітин.

Клонування транскриптов, що беруть участь в трасі сигналу

Було виявлено, що ген кінази MAP сверхекспрессіруется після того, як рослини піддаються обробки саліцилової кислотою. Відомо, що MAP-кіназа грає важливу роль в фосфорилировании і дефосфорилюванні білка в шляху передачі сигналів (Montesano, 2002). Мітоген-активована протеинкиназа (MAP-кіназа), серин / треонін-специфічна киназа, реагує на екзогенні стимули, такі як мітогени, осмотичний стрес і тепловий стрес, за допомогою регулювання множинних клітинних активностей, таких як експресія генів, мітоз, диференціювання клітин, поділ клітин і апоптоз, ріст клітин і клітинна захист (Kant et al., 2006). Надекспресія MAP-кінази ідентифікували за допомогою полуколичественной RT-PCR (фіг. 2а). Був виявлений амплікон розміром 373 п.н, де експресія збільшувалася після одного дня обробки, і це збільшення зберігалося до останнього дня обробки (4-й день). Було висловлено припущення, що надекспресія MAP-кінази на ранній стадії може згодом викликати продукування етилену і жасмонової кислоти з подальшим продукуванням фенілпропаноїди і вторинних метаболітів (Zhao et al., 2005).

Саркозіноксідаза

Багато генів запускаються в каскадних реакціях після активації сигнального шляху MAP-кінази. Одним з генів є ген, який кодує саркозіноксідазу, яка бере участь в метаболізмі гліцину, серину і треоніну. Він каталізує окисне деметилювання саркозина і генерує еквімолярних кількості формальдегіду, гліцину і перекису водню (Nishiya, 2000). Виробництво пероксиду водню важливо для рослинних клітин, оскільки воно служить в якості субстрату пероксидазних реакцій, таких як зшивання коричного спирту під час біосинтезу лігніну і зшивання екстензіна клітинної стінки (Barcelό, 1998) для додання сили клітинної стінки. Диференційно експресується кодон EST-клона (GT742115), що кодує саркозіноксідазу. Рівень експресії транскрипта цього гена був визначений, і він показує, що транскрипт був виявлений навіть на необроблених листах (контроль), але на низькому рівні (рис. 2е). Проте більш високий рівень експресії транскрипта присутній в усі моменти часу, вказуючи на те, що саліцилова кислота викликала його вираз.

Трансглутамінази

Інший EST-клон, який, як було відмічено, диференційно експресується, являє собою трансглутаміназу (GT742142, GT742144 і GT742145). Трансглутамінази є фермент трансферази, що залежить від кальцію, який бере участь у багатьох реакціях схрещування білка під час росту рослин і тварин (Dondini et al., 2002). Реакція, що каталізується трансглутамінази, генерує Nepsilon- (γ глутаміл) лізин між білками. Трансглютаміназа каталізує посттрансляційної модифікації шляхом трансамідірованія залишків глутаміну і продукує між- і внутріізопептідние зв’язку численних білків шляхом зшивання Аміновен залишку з лізином і білками глютамина (Bönisch et al., 2007). Трансглютаміназа також грає невід’ємну роль у виживанні проти осмотичного і сольового стресу (Dondini et al., 2002). Крос-посилання впливають на функцію білка бо вони сприяють зміцненню структури (Bönisch et al., 2007), наприклад, при каталізі модифікації цитоскелета (Del Duca et al., 1997). За полуколичественной ОТ-ПЦР ми спостерігали, що експресія трансглутамінази (GT742142) збільшувалася при обробки саліцилової кислотою до третього дня, перш ніж вона знову почала зменшуватися (рис. 2б). Крім того, в цьому дослідженні геном цитоскелетного актину (GT742111) також клонували як диференційно експрессіруемий ген. Експресія актинового цитоскелета пов’язана з організацією микротрубочек, ураженої розщепленням або подовженням шпинделів, освітою мікротрубочних айстр в мітотичних клітинах і подовженням микротрубочек фрагмопластов (Smertenko et al., 1997). Однак кореляція між трансглутамінази і Актинові цитоскелетом в цьому дослідженні залишається невідомою.

Білки теплового шоку (HSP)

У багатьох дослідженнях визначення HSP в important crops має вирішальне значення, оскільки HSP дозволяють розвивати високу температуру і посухостійкість в рослинах. У цьому дослідженні клонували кілька HSP (GT735563, GT735560, GT735561, GT742121, GT735550, GT735551 і GW610913) і шаперон (GT742123). HSP пов’язані з процесами модифікації, які дозволяють уникнути білків і / або відновлюватися після агрегації під час стресу. Реакція теплового удару є індуцібельная молекулярним відповіддю на фізіологічні, екологічні та біохімічні стресові умови, що призводить до підвищення експресії HSP. На молекулярному рівні рясний синтез HSP зберігається у всіх організмах при впливі підвищених температур (Boyer et al., 2008). Тим часом, молекулярні шаперони часто характеризуються їх здатністю запобігати агрегацію розгортаються білків, що утворюються у відповідь на слабку кислоту або термічну обробку. Коли рослини піддаються тепловому стресу, гомеостаз порушується, що призводить до дестабілізації білка. HSP пов’язують з цими білками, щоб захистити їх від агрегації. Тим часом, вони діють як шапероновие молекули, які функціонують в згортанні білка і біохімічних реакціях для забезпечення сталого гомеостазу з точки зору рН і метаболітів (Boyer et al., 2008). Щоб зрозуміти їх структуру експресії, Напівкількісний ОТ-ПЦР проводили на одному з EST-клонів, відповідних HSP; смуга, що представляє рівень HSP після обробки, була більш інтенсивною, ніж до обробки (рисунок 2н). Дослідження по HSP привернули значну увагу в області трансгенних досліджень. Дослідження, проведене на трансгенних томатах з надлишковою експресією HSP показали, що ці томати більш терпимі до нагрівання. Це спостереження узгоджується з іншим дослідженням, проведеним на рисі, в якому у трансгенного рису спостерігалося меншу кількість плям, ніж у дикого рису при впливі теплового стресу, що вказує на збільшення индуцируемой теплоємності (Wang et al., 2003), де в нормальних умовах HSP або не виражений, або виражений, але на низькому рівні.

Зв’язуючий білок хлорофілу a-b

Коли рослини знаходяться в стані стресу, багато генів, прямо або побічно належать до реакції на стрес, стають яскраво вираженими для того, щоб адаптуватися до умов, що склалися навколишнього середовища. Протеїн для зв’язку a-b хлорофілу (Chlorophyll a-b binding protein, CAB, GT735555, GT735556 і GT742124) несе відповідальність за поглинання світла під час фотосинтезу в фотосистеми I і II (Andersson et al., 2003). У той же час, N-Кінець (аміно-кінець), який розширюється в строму, бере участь в прив’язці до мембрани грани, контрольований оборотної фосфорелляціей залишків теоніна, де фосфореляція і дефосфореляція керують розподілом енергії збудження між фотосистемою I і II (Liu and Shen , 2004). Накопичення CAB і апопротеина збільшувалася в результаті стабілізації фотосистеми. Проте, надмірне вираження CAB захищає фотосистему шляхом стабілізації розподілом світла між фотосистемою I і II (Andersson et al., 2003)

Виробництво вторинного метаболіту в результаті стимуляції АФК

Метою даного дослідження було визначення того, чи зможуть гени, які кодують вторинні похідні метаболітів, бути клонованими після обробки за допомогою саліцилової кислоти. Абіотичні стреси, такі як посуха, солоність і повінь може спровокувати генерацію АФК, яка токсична для клітин рослин. Уражені мембрани, мембрани структури та інші макромолекули, такі як білок і нуклеїнова кислота, особливо в мітохондріях і хлоропласті. Ці події надають окислювальний стрес на клітини. Протягом окисного стресу супероксиддисмутаза відповідає за деіонізірующіе супероксиди, перетворивши їх в перекис водню, які згодом будуть розкладатися в воду каталазой і пероксидазою. Згідно Zhao et al. (2005), елісітори індукують трансдукцію генів, що кодують АФК-ферменти, які відомі пошкодженням мембрани, мітохондрії і ядра протягом реакції на множинні стреси (Murakami et al., 1997, Rhoads et al., 2006). У цьому дослідженні два транскрипта оксидоредуктаз клонування гомологами старого жовтого ферменту (GW610915) і аденілілсульфатредуктази (глутатіон) (GT742127). Старий жовтий фермент бере участь у виробництві NADP / NADPH, окислювача і відновника, тоді як аденілілсульфатредуктаза – в очищенні і детоксикації АФК. Хоча вільно-радикальні реактивні кисневі проміжні сполуки (ROI) шкідливі для клітини, вони забезпечують передачу сигналу, який активує систему захисту. Тому ROI, такі як H_2 O_2 і 〖O_2〗 ^ -, є індикаторами клітинного стресу і вторинним сигналом в реакції на трансдукцію сигналу напруги шляху (Mittler, 2001).

Гени на шляху біосинтезу лігніну

Оскільки гібридизація кДНК і напівкількісна ОТ-ПЦР на увазі, що секвенований клони активуються, також як інші транскрипти, такі як SAD і CAD. З попередніх спостережень слід розуміти, що прокатка листів зменшує втрату води, освіту лігніну також зменшує втрату води. SAD-фермент (GT742125) грає роль в каталізації останнього кроку в біосинтезі лігніну, званим гідроксілціннамілом, тоді як його Ортолог CAD (GT742138), бере участь в шляху біосинтезу фенілпропаноїди для створення лігніну (Li et al., 2001). Хоча CAD і SAD каталізують ту ж реакцію через їх схожості послідовностей, активна ділянка SAD відрізняється від прогнозованого активного ділянки СAD. Шлях, в який включені SAD і CAD – це шікіматний шлях фенілоаланіна, який прямує в шляху, що продукують вторинні метаболіти, такі як алкалоїди, флаваноіди, лігнін і білка. Тому цілком можливо, що обробка 100 мМ саліцилової кислоти може викликати вторинне виробництво метаболітів.

Виробництво альдітов, як засіб захисту від осмотичного стресу

Крім вторинних метаболітів альдіти також грають важливу роль в захисті від стресу. Альдоредуктази (GT742129) змінює глюкозу до сорбіту, тоді як маннітолдегідрогеназа (GT735567) функціонує при перетворенні D-маніту і NAD-іон в D-маноза, NADH і H +. Присутність альтіда-сорбіту обумовлено осмотическим стресом. Це узгоджується з роллю маннита в захисті рослин від стресу солоності. The advantage for higher plants which metabolize mannitol is on sugar translocation whereby increased tolerance to salt and osmotic stress, other than protecting means during pathogenic invasionm (Stoop et al., 1995). Цукор для осмолітового спирту є сумісним розчинним речовиною, яке збільшує осмотичний потенціал в рослинах, де він грає вирішальну роль в підтримці клітини turgidity шляхом створення осмотических градієнтів для просування води (Wang et al., 2003). Тому маннит дегидрогеназа також відіграє вирішальну роль в руйнуванні ROS.

LEA (пізній ембріогенез) білків

Так як саліцилова кислота викликала в’янення листя M. speciosa, клонування LEA-транскрипту (GT735565) означає накопичення LEA в оброблених листі M. speciosa. Спочатку наблюдлося збільшення білків LEA під час дозрівання бавовни (Gossypium hirsutum) і ембріогенезу. LEA білки присутні в рослинах, однак їх точна роль залишається невідомою. Тим не менш, багато дослідження вказують на те, що білки LEA грають роль в захисті і стабілізації клітин мембрани. Таким чином, білки LEA пов’язані зі здатність утримувати воду і запобігати кристалізацію важливих клітинних білків та інших молекул під час висихання. Оскільки обробка саліцилової кислотою викликала висушування листя і в’янення, ми припустили, що білки LEA можуть бути експресувати для стабілізації клітинної мембрани від ушкоджень, викликаних висиханням.

Білки-транспортери

Один з механізмів, задіяний під час теплового стресу, що включає, транспортування розчиненої речовини. З нашої бібліотеки SSH один EST-клон показує гомологию транспортера сахарози (GT742140). За напівкількісним ОТ-ПЦР, ми спостерігали надекспресія сахарози в останній день обробки саліцилової кислотою. З попередніх досліджень повідомлялося, що надлишкова експресія sucrose transporter завжди спостерігалася під час теплового стресу. У дослідженні Qin (2008) також повідомляється про збільшення sucrose transporter за допомогою мікрочіпа. У дослідженні було виявлено, що вміст цукру Triticum aestivum значно збільшилася при тепловому стресі, і це, ймовірно, було через ролі цукру в підтримці гомеостазу при тепловому стресі (Qin et al., 2008).

Детоксикаційні ферменти і вторинні метаболіти

Ферменти CYP450 (GT742126) представляють собою надродина гемосодержащіх ферментів монооксигенази. Вони важливі в біосинтезі декількох з’єднань, таких як гормони, захисні сполуки і жирні кислоти (Nebert et al., 1989). Експресія CYP450 пов’язана з M. speciosa вторинним метаболізмом: під час стресу одим з механізмів, який активує виживання біосинтезу ксенобіотиків. Щоб подолати окислювальний стрес, аденілілсульфатредуктаза (GT742127) активізує ініціацію первинної реакції засвоєння сульфатів рослинами, яка продукує цистеїн і антиоксидант глутатіон (Bick et al., 2001). Окислювальний стрес, викликаний виробництвом ROS може бути зменшений за рахунок збільшення виробництва окисленого глутатіону шляхом продукування глутатіону GSTs (GT742126), оскільки GST є найбільшим детоксикаційної ферментної групою, крім інших поглиначів ROS такі як: пероксидаза аскорбата, супероксиддисмутаза, глутатіонпероксидази, феритин і тіоредоксін (Qin et al., 2007). GSTs catalyze reduced glutathione conjugation through sulfhydryl groups to the hydrophilic center of multiple substrates, detoxify endogenous compounds such as lipid peroxide and promote xenobiotics degradation. Крім того, виробництво H_2 О_2 і ROS такожіндукує GST вираз, яке відіграє роль в захисті від хімічних генеруються електрофілов (Das et al., 2010).

Гліколат-оксидаза (S-гідроксикислотний оксидаза)

Крім порушення фотосинтезу, стрес також приводив до накопичення цукру. Накопичення сахарози під час стресу збільшує його непроникність. Ключовим ферментом photorespiratory шляхів є сахароза поскольу гліколатоксідаза є проміжним етапом у транслокації білків. Тому збільшення експресії гліколатоксідази (GT742133) відіграє певну роль транспортування сахарози. Крім цього, гліколятоксідаза також грає роль у виробництві серина для підтримки збалансованого клітинного гомеостаз. Однак це дослідження суперечить дослідженню негативного впливу посухи та теплового шоку на експресію генів (Rizhsky et al., 2002), де гліколятоксідаза була пригнічена. Передбачається, що існують інші механізми, які беруть участь в цій обробки, які є причиною невідповідності результатів. Надлишкова експресія була проілюстрована через Напівкількісний аналіз ОТ-ПЦР (малюнок 2г); збільшення експресії гліколятоксідази було очевидним після першого дня обробки, і збільшення зберігалося до кінця обробки.

Висновок

Цілком очевидно, що обробка 100 мМ саліцилової кислоти виявилася занадто сильною для M. speciosa, тому що рослина піддалося стресового стану і надмірно вираженого стресу пов’язаних генів. Метод супрессіонной віднімає гібридизації, як було доведено, є потужним інструментом в демонстрації диференціальної експресії генів при абіотичних стресів. These findings either from them M. speciose suppression subtractive library or the semi-quantitative RTPCR agree with the heat stress mechanism from other previous studies, in which in order to cope with heat stress, plants implement various mechanisms, including maintenance of membrane stability, scavenging of ROS, production of antioxidants, accumulation and adjustment of compatible solutes, induction of mitogen-activated protein kinase (MAPK) and calcium-dependent protein kinase (CDPK) cascades, and, most importantly, chaperone signaling and transcriptional activation. Надалі аналіз використання білка, пов’язаного з нагріванням, може бути здійснено, коли будуть доступні клони.