1. Введення
Mitragyna speciosa (Крат), чий ефект схожий з ефектом коки і опіуму, використовувався в Таїланді. Крім того, він використовувався для лікування діареї і морфінізму (Jansen and Prast, 1988). Ця лікарська трава містить багато алкалоїдів індолу (Houghton et al., 1991; Takayama et al., 1999, 2000). Мітрагінін є основним компонентом листя кратома (Takayama et al., 2000). Нещодавно ми виявили, що мітрагінін діє на μ-опіоїдні рецептори в клубової кишці морської свинки (Watanabe et al., 1997; Yamamoto et al, 1999). Крім того, деякі фармакологічні дослідження показали, що мітрагінін володіє антиноцицептивного дією через супраспінальних μ- і δ-опіоїдні рецептори (Matsumoto et al., 1996a, b; Tohda et al., 1997; Thongpradichote et al., 1998). Однак антиноцицептивного ефект мітрагінін менш ефективний, ніж у неочищеного екстракту цієї рослини (Watanabe et al., 1999). Тобто опійний ефект кратома не може бути повністю пояснений наявністю мітрагінін. Цей висновок свідчить, що незначні складові кратома мають дуже сильним антиноцицептивного ефектом. Однак ця рослина до цих пір систематично не досліджено для виділення опіоїдних агоністичних компонентів. У даній статті ми описуємо поділ сирого екстракту кратома і досліджувати активних компонентів, які мають опіоїдних агоністичного активність з використанням in vivo випробування стиснення клубової кишки морської свинки. Крім того, ми досліджували опиоид агоністичної активності напівсинтетичних сполук, отриманих з мітрагінін, для з’ясування специфічної структури, необхідної для зв’язування його фармакофор з опіоїдними рецепторами.
2. Матеріали і методи
Тварини
Всі експерименти проводилися відповідно до «Керівними принципами догляду та використання лабораторних тварин», схваленими Японським фармакологічним суспільством. Кількість використовуваних тварин було зведено до мінімуму, необхідного для значущою інтерпретації даних, також дискомфорт тварин був зведений до мінімуму. Самці морської свинки альбіноса (320-540 г, Takasugi Lab. Тварини, Японія) були вбиті при вдиханні СО2.
Виділення клубової кишки морської свинки
Клубову кишку морської свинки розчленовували і поміщали в розчин Кребса-Хенселейта (мМ): NaCl, 112,08; KCl, 5,90; CaCl2, 1,97; MgCl2, 1,18; NaH2PO4, 1,22; NaHCO3, 25,00 і глюкози, 11,49. Клубову кишку поміщали під напругу (1g) в інкубатор органів з 5 мл живильного розчину. Інкубатор підтримували при 37ºC і безперервно барботіровалі сумішшю 95% O2 і 5% CO2. Тканини були простимульовані за допомогою платинового голчастим-кільцевого (кільце було розміщено на 20 мм вище підстави голки, довжиною в 5 мм) електрода. Після 60 хвилинного врівноваження в розчині Кребса-Хенселейта клубова кишка була трансмуральному простимульована (Cox and Weinstock, 1966) з монофазним імпульсами (тривалість 0,2 Гц і 0,1 мс) стимулятором (SEN-7203, Nihon Kohden, Токіо, Японія). Скорочення були записані ізотонічний, використовуючи перетворювач зміщення (NEC Type 45347, San-ei Instruments Ltd., Токіо, Японія). Був досліджений ефект медикаментозного лікування скорочень, викликаних трансмуральної стимуляцією через кільцеві електроди. На початку кожного експерименту, перевіряючи стабільність, фіксували максимальний відгук на ацетилхолін (3 мкм) в кожної тканини. Середня амплітуда електрично стимульованого скорочення становила близько 30% максимального відгуку на ацетилхолін (3 мкм). Електрично індуковане скорочення було майже скасовано тетродотоксином (1 мкМ) і атропіном (0,1 мкм), як описано раніше (Watanabe et al., 1997). Таким чином, електрична стимуляція індукувати холінергічні скорочення в клубової кишці морської свинки (Brookes et al., 1991). Висоту судомної реакції до трансмуральної стимуляції вимірювали до і після випробування медикаментами. Скорочення (%), виражене у відсотках від судомної реакції на трансмуральних стимуляцію перед випробуванням препарату. (Оригінал: The height of the twitch response to transmural stimulation was measured before and after the drug challenge. Contraction (%) is expressed as a percentage of the twitch response to the transmural stimulation before the drug challenge.)
Рослинний матеріал
Листя кратома були зібрані на кампусі факультету фармацевтичних наук, Чулалонгкорнского університету. Рослина було ідентифіковано доктором Нійсірі Руангрюнсі (факультет фармацевтичні науки, Чулалонгкорнскій університет). Зразок ваучера (№ 1991Dec-MS) був депонований в гербарій факультету фармацевтичних наук Чулалонгкорнского університету.
Хімія
Щоб дослідити взаємозв’язок «структура-активність», з екстракту листя кратома був виділений мітрагінін. Пов’язані з мітрагінін алкалоїди індолу були синтезовані з мітрагінін, як описано раніше (Takayama et al., 2002, 2004). Чистоту (> 99%) цих сполук перевіряли за допомогою ВЕРХ та 1 H-ЯМР (500 МГц) (Takayama et al., 2002).
Медикаменти
Препаратами, які були використані в цьому дослідженні, є: ацетілхолінхлорід (Dai-ichi Pharmaceutical Co., Токіо, Японія), атропін сульфат (Nacalai Tesque Inc., Токіо, Японія), тетродотоксин (Sankyo, Токіо, Японія), гідрохлорид морфіну ( Takeda Chemical Industries, Осака, Японія) і налорфина гідрохлорид (Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, США). Спочатку для біопроб брали, пов’язані з мітрагінін алкалоїди, і расстворялі їх в 100% диметилсульфоксиде з отриманням 10 мМ розчину і після розбавляли дистильованою водою. Інші лікарські засоби також розчиняли в дистильованої воді.
Статистичний аналіз
Дані виражаються як середнє ± S.E.M. Статистичний аналіз проводили з Двухвиборочний t – тестом, для порівняння двох груп, і одностороннім аналізом дисперсії, з подальшим використанням методу поправки Бонферроні для порівняння більш ніж двох груп. Значення Р <0,05 розглядалося як статистично значуще.
3. Результати
Вплив неочищеного екстракту на електрично стимульоване скорочень
По-перше, опіоїдних агоністичного активність неочищеного екстракту кратома оцінювали, використовуючи судорожне скорочення, викликане електричною стимуляцією в клубової кишці морської свинки. Неочищений екстракт (1-300 мкг / мл) ингибировал судоми в залежності від концентрації. Ефект антагоніста опіоїдних рецепторів налоксону на інгібування скорочень досліджували, щоб переконатися, що екстракт діє на опіоїдні рецептори. Вплив неочищеного екстракту було скасовано налоксоном. Налоксон (30-300 нМ) також ингибировал дію морфіну, але не впливав на ефект верапамілу, блокатора каналу 〖Ca〗 ^ (2 +) L-типу, при скороченні судом. Передбачається, антагоністичний ефект налоксону специфічний для опіоїдних рецепторів. Неочищений екстракт послідовно Фракціоновані на неочищена підставу, н-BuOH і водні фракції. Серед них було виявлено, що тільки неочищений основний екстракт проявляє гальмування судомного скорочення. Інгібуючий ефект залежить від концентрації (1-100 мкг / мл). AcOH-нерозчинний, n-BuOH і водорозчинні фракції (10-300 мкг / мл) практично не впливали на подвздошное судорожне скорочення. В ході колоночной хроматографії (з силікагелем) неочищеної основної фракції було виділено п’ять алкалоїдів: 7-гідроксімітрагінін, мітрагінін, speciogynine, speciociliatine і paynantheine. Кожен алкалоїд ингибировал електрично індуковане судорожне скорочення в залежності від концентрації. Серед них 7-гідроксімітрагінін показав найбільш сильний вплив на скорочення клубової кишки. Ефективність була в 30 і 17 разів вище, ніж у мітрагінін і морфіну відповідно. Налоксон (30, 300 нМ) відновлював судорожне скорочення, інгібувати 7-гідроксімітрагініном.
Вплив пов’язаних з мітрагінін алкалоїдів індолу на електрично стимульоване скорочення
Опіоїдна агоністичного активність природного аналога мітрагінін і напівсинтетичного з’єднання, отриманого з мітрагінін, оцінювали шляхом вимірювання скорочення судом, індукованих електростимуляцією в клубової кишці морської свинки. Мітрагінін гальмував судомні скорочення, викликані електричною стимуляцією, з ефективністю близько 58% від результату, які показував морфін. У дослідженні взаємозв’язку «структура-активність», ми спочатку звернули увагу на наявність метоксільних групи в положенні С9 на індольної кільці в мітрагінін. 9-деметоксі-аналог мітрагінін, корінантідін, не виявляв ніякої опіоїдної агоністичної активності взагалі, але скасував морфінової інгібувати судомних скорочень в клубової кишці морської свинки. Його антагоністичний ефект залежав від концентрації (дані не показані). 9-диметиловий аналог мітрагінін, 9-hydroxycorynantheidine, також пригнічує електрично індуковане судорожне скорочення, але його максимальний відсоток інгібування був нижче, ніж у мітрагінін. 9-Ацетоксімітрагінін продукував зниження як внутрішньої активності, так і ефективності в порівнянні з мітрагінін. 9-Метоксіметілкорілангідін не виявляв опіоїдної агоністичної активності. Потім ми досліджували трансформацію заступника в положенні С7. 7-гідроксімітрагінін ингибировал електрично стимульоване судорожне тремтіння в залежності від концентрації, також як мітрагінін і морфін. Значення pD2 становили 8,38 ± 0,12 для 7-гідроксімітрагініна, 6,91 ± 0,04 для мітрагінін і 7,15 ± 0,05 для морфіну. Введення метокси, етокси- або ацетоксі- груп в положенні С7 (7-метоксімітрагінін, 7-етоксімітрагінін або 7-ацетоксімітрагінін) призвело до помітного зниження як максимального інгібування, так і відносної активності опіоїдних рецепторів. Значення pD2 становили 6,45 ± 0,04 для 7-метоксімітрагініна, 5,29 ± 0,12 для 7-етоксімітрагініна, і 6,50 ± 0,16 для 7-ацетоксімітрагініна.
4. Обговорення
Опіоїдний ефект екстракту
Крат традиційно використовується в якості замінника опіуму в тропічних районах (Jansen and Prast, 1988). Ми виявили, що мітрагінін, що є основним компонентом цієї рослини, викликає опіоїдний агонистический ефект в клубової кишці морської свинки (Watanabe et al., 1997; Yamamoto et al, 1999). В даний час ми спробували знайти опіоїдні агоністичні елементи, відмінні від мітрагінін. Опіоїдних агоністичного активність неочищених і фракційних екстрактів оцінювали за допомогою судомних скорочень, індукованих електростимуляцією в клубової кишці морської свинки. Неочищений екстракт ингибировал скорочення, які були скасовані налоксоном. Цей результат демонструє, що екстракт надає опіоїдний агонистический ефект.
Опіоїдний ефект алкалоїдів
Грунтуючись на результатах діяльності різних фракцій, активні компоненти були вилучені з неочищеної основної фракції. Цей фракційний екстракт хроматографіровалі з отриманням п’яти з’єднань. Oни були ідентифіковані як 7-гідроксімітрагінін, мітрагінін, speciogynine, paynantheine, і speciociliatine шляхом прямого порівняння з відповідними автентичними зразками. Кожен алкалоїд пригнічує електрично індуковане судорожне скорочення в залежності від концентрації. Так само було виявлено опіоїдний агонистический ефект мітрагінін, як повідомлялося раніше (Watanabe et al., 1997; Yamamoto et al., 1999). 7-Гідроксімітрагінін є окислене похідне мітрагінін і незначну складову листя кратома (Ponglux et al., 1994). Інгібуючу дію 7-гідроксімітрагінін було скасовано налоксоном, що вказує на участь опіоїдних рецепторів. Серед компонентів, виділених в цьому дослідженні, 7-гідроксімітрагінін показав найбільш сильну активність. Ефективність, розрахована з використанням значень pD2, була приблизно в 30 і 17 разів вище, ніж у мітрагінін і морфіну відповідно. У поєднанні з цієї ефективністю передбачається, що опіоїдний ефект кратома заснований на активності 7-гідроксімітрагініна.
Опіоїдний ефект алкалоїдів, пов’язаних з мітрагінін
Відкриття сильних опіоїдних ефектів мітрагінін і 7-гідроксітірагініна спонукало нас розпочати синтез нових сполук свинцю на основі структури мітрагінін. Ми спочатку звернули нашу увагу на метокси групу в положенні С9 на індольної кільці в мітрагінін, тому що структурна характеристика алкалоїдів Мітрагіни, в порівнянні зі звичайними алкалоїдами індолу типу Corynanthe, ізольовані від інших рослин (Lounasmaa et al., 1994). Цікаво, що перетворення заступника в С9, тобто з Омі в Н, призвело до зміщення внутрішньої активності від повного агоніста до антагоніста опіоїдних рецепторів. Таким чином, було виявлено, що функціональна група при C9 з’єднаннях, пов’язаних з мітрагінін, управляє відносної інгібуючої активністю, який відповідає за внутрішню активність опіатнихрецепторів. Введення ацетоксігруппи в C9 на індольної кільці (9-ацетоксімітрагінін) призвело до помітного зниження як внутрішньої активності, так і ефективності в порівнянні з мітрагінін. 9-деметільний аналог мітрагінін, 9-hydroxycorynantheidine, пригнічує електрично індуковане судорожне скорочення, але його максимальне інгібування було майже вдвічі нижче, ніж у мітрагінін. Тому передбачається, що 9-hydroxycorynantheidine може мати часткові агоністичні властивості. 9-Methoxymethylcorynantheidine не виявляв опіоїдної агоністичної активності. Нинішні результати показують, що власна активність сполук на опіоїдних рецепторах визначена функціональними групами в положенні С9, а також метоксігруппи в положенні С9 є найбільш придатною функціональною групою для зв’язування фармакофор з опіоїдними рецепторами. Було виявлено, що 7-гідроксімітрагінін, незначний компонент кратома, має високу ефективність по відношенню до опіоїдних рецепторів. Внутрішня активність 7-гідроксімітрагініна свідчить про його повному агоністичного впливі на опіоїдні рецептори. Введення гідроксильної групи в положення С7 призвело до підвищення ефективності в порівнянні з мітрагінін. Тому ми звернули нашу увагу на перетворення заступника в положенні С7. Введення метокси, етокси- або ацетокси-групи в C7 призвело до помітного зниження як внутрішньої активності, так і ефективності щодо опіоїдних рецепторів. Ці результати показують, що гідроксильна група в положенні С7 в структурі мітрагінін є необхідною для збільшення ефективності по відношенню до опіоїдних рецепторів. В ході нашого дослідження ми вивчили складові кратома і напівсинтетичні сполуки, похідні від мітрагінін. Серед них ми знайшли два цікавих з’єднання. Одним з них є 7-гідроксімітрагінін, який показав найбільш сильний ефект в складі кратома і пов’язаних з мітрагінін з’єднаннях. Інший – 9-hydroxycorynantheidine, який володіє частковими агоністичними властивостями. У пошуках альтернативних для морфіну анальгетиків, опіоїди, що демонструють частковий профіль агоніста, дали хороші результати. Наприклад, бупренорфін, який є частковим опіоїдних агоністом, який використовується клінічно для лікування болю. Також, останнім часом, використовувався як альтернатива метадону в підтримці і детоксикації героїновий наркоманів (Bickel et al., 1988; Kosten and Kleber, 1988). У наступному розділі ми досліджуємо повні та часткові агоністичні характери 7-гідроксімітрагінін і 9-гідроксікорілангідін, відповідно.
Резюме
У цьому розділі ми описали опіоїдні ефекти компонентів, виділених з кратома і напівсинтетичні сполуки, отримані з мітрагінін. Серед них, 7-гідроксімітрагінін показав найбільш сильний опіоїдний ефект, який був в 17 разів сильніше, ніж морфін. 9-Hydroxycorynantheidine, 9-деметільний аналог мітрагінін, показав часткове агоністичними дію на опіоїдні рецептори в клубової кишці морської свинки.
